Principes en methoden voor kwantitatieve analyse door vloeistofchromatografie

Het scheidingsmechanisme van vloeistofchromatografie is gebaseerd op het verschil in affiniteit van de componenten in het mengsel voor de twee fasen.

Volgens de verschillende stationaire fasen wordt vloeistofchromatografie onderverdeeld in vloeistof-vaste stofchromatografie, vloeistof-vloeistofchromatografie en gebonden fasechromatografie.De meest gebruikte zijn vloeistof-vaste stofchromatografie met silicagel als vulmiddel en gebonden fasechromatografie met microsilica als matrix.

Volgens de vorm van de stationaire fase kan vloeistofchromatografie worden onderverdeeld in kolomchromatografie, papierchromatografie en dunnelaagchromatografie.Afhankelijk van het adsorptievermogen kan het worden onderverdeeld in adsorptiechromatografie, partitiechromatografie, ionenuitwisselingschromatografie en gelpermeatiechromatografie.

In de afgelopen jaren is aan het vloeistofkolomchromatografiesysteem een ​​hogedrukvloeistofstroomsysteem toegevoegd om de mobiele fase snel onder hoge druk te laten stromen om het scheidingseffect te verbeteren, dus hoogefficiënte (ook bekend als hogedruk) vloeistofchromatografie is tevoorschijn gekomen.

DEEL
01 Principe van kwantitatieve analyse van vloeistofchromatografie

Om te kwantificeren op basis van kwalitatieve, zijn zuivere stoffen als norm nodig;

Kwantificering via vloeistofchromatografie is een relatief kwantitatieve methode: dat wil zeggen dat de hoeveelheid analyt in het mengsel wordt geschat op basis van een bekende hoeveelheid zuiver standaardmonster.

DEEL
02 Basis voor kwantificering door vloeistofchromatografie

De hoeveelheid van de gemeten component (W) is evenredig met de responswaarde (A) (piekhoogte of piekoppervlak), W=f×A.

Kwantitatieve correctiefactor (f): Het is de evenredigheidsconstante van de kwantitatieve berekeningsformule, en de fysieke betekenis ervan is de hoeveelheid van de gemeten component die wordt weergegeven door de eenheidsresponswaarde (piekoppervlak).

De kwantitatieve correctiefactor kan worden verkregen uit de bekende hoeveelheid standaardmonster en de responswaarde ervan.

Meet de responswaarde van de onbekende component en de hoeveelheid van de component kan worden verkregen door de kwantitatieve correctiefactor.

DEEL
03 Veelgebruikte termen in kwantitatieve analyse

Monster (monster): een oplossing die een analyt bevat voor chromatografische analyse.Verdeeld in standaard en onbekende monsters.

Standaard: Een puur product met een bekende concentratie.Onbekend monster (onbekend): Het mengsel waarvan de concentratie moet worden getest.

Monstergewicht: De oorspronkelijke weging van het te testen monster.

Verdunning: De verdunningsfactor van het onbekende monster.

Component: de chromatografische piek die kwantitatief moet worden geanalyseerd, dat wil zeggen de analyt waarvan de inhoud onbekend is.

Hoeveelheid component (hoeveelheid): de inhoud (of concentratie) van de te testen stof.

Integriteit: het rekenproces waarbij het piekoppervlak van een chromatografische piek wordt gemeten door een computer.

Kalibratiecurve: een lineaire curve van de componentinhoud versus de responswaarde, vastgesteld op basis van een bekende hoeveelheid standaardstof, gebruikt om de onbekende inhoud van de analyt te bepalen.

DEEL
04 Kwantitatieve analyse van vloeistofchromatografie

1. Selecteer een chromatografische methode die geschikt is voor kwantitatieve analyse:

l Bevestig de piek van de gedetecteerde component en bereik een resolutie (R) groter dan 1,5

l Bepaal de consistentie (zuiverheid) van de chromatografische pieken van de geteste componenten

l Bepaal de detectielimiet en kwantificeringslimiet van de methode;gevoeligheid en lineair bereik

2. Stel een kalibratiecurve op met standaardmonsters van verschillende concentraties

3. Controleer de nauwkeurigheid en precisie van kwantitatieve methoden

4. Gebruik de bijbehorende chromatografiebeheersoftware om monsterverzameling, gegevensverwerking en rapportageresultaten te implementeren

DEEL
05 Identificatie van kwantitatieve pieken (kwalitatief)

Identificeer op kwalitatieve wijze elke te kwantificeren chromatografische piek

Gebruik eerst het standaardmonster om de retentietijd (Rt) van de te kwantificeren chromatografische piek te bepalen.Zoek door de retentietijd te vergelijken de component die overeenkomt met elke chromatografische piek in het onbekende monster.De chromatografische kwalitatieve methode is het vergelijken van de retentietijd met het standaardmonster.Het criterium Onvoldoendeverdere bevestiging (kwalitatief)

1. Standaard optelmethode

2. Gebruik tegelijkertijd andere methoden: andere chromatografische methoden (verander het mechanisme, zoals: gebruik van verschillende chromatografische kolommen), andere detectoren (PDA: spectrumvergelijking, zoeken naar spectrumbibliotheek; MS: massaspectrumanalyse, zoeken naar spectrumbibliotheek)

3. Andere instrumenten en methoden

DEEL
06 Bevestiging van kwantitatieve piekconsistentie

Bevestig chromatografische piekconsistentie (zuiverheid)

Zorg ervoor dat er zich slechts één gemeten component onder elke chromatografische piek bevindt

Controleer op interferentie door mee-eluerende stoffen (onzuiverheden)

Methoden voor bevestiging van chromatografische piekconsistentie (zuiverheid)

Spectrogrammen vergelijken met fotodiodematrixdetectoren (PDA).

Identificatie van piekzuiverheid

2996 Zuiverheidshoektheorie

Kwantitatieve methoden die vaak worden gebruikt in DEEL 07

Standaardcurvemethode, onderverdeeld in externe standaardmethode en interne standaardmethode:

1. Externe standaardmethode: meest gebruikt in vloeistofchromatografie

Er werd een reeks standaardmonsters met bekende concentraties bereid met gebruikmaking van zuivere monsters van de als standaardmonsters te testen verbindingen.geïnjecteerd in de kolom tot aan de responswaarde (piekoppervlak).
Binnen een bepaald bereik bestaat er een goede lineaire relatie tussen de concentratie van het standaardmonster en de responswaarde, namelijk W= f×A, en wordt er een standaardcurve gemaakt.

Injecteer onder exact dezelfde experimentele omstandigheden het onbekende monster om de responswaarde van de te meten component te verkrijgen.Volgens de bekende coëfficiënt f kan de concentratie van de te meten component worden verkregen.

De voordelen van de externe standaardmethode:eenvoudige bediening en berekening, het is een veelgebruikte kwantitatieve methode;het is niet nodig dat elke component wordt gedetecteerd en geëlueerd;standaardmonster is vereist;de meetomstandigheden van het standaardmonster en het onbekende monster moeten consistent zijn;het injectievolume moet nauwkeurig zijn.

Nadelen van de externe standaardmethode:De experimentele omstandigheden moeten hoog zijn, zoals de gevoeligheid van de detector, de stroomsnelheid en de samenstelling van de mobiele fase kunnen niet worden gewijzigd;het volume van elke injectie moet een goede herhaalbaarheid hebben.

2. Interne standaardmethode: nauwkeurig, maar lastig, het meest gebruikt in standaardmethoden

Een bekende hoeveelheid van de interne standaard wordt aan de standaard toegevoegd om een ​​gemengde standaard te maken, en er wordt een reeks werkstandaarden met een bekende concentratie bereid.De molaire verhouding tussen standaard en interne standaard in de gemengde standaard blijft ongewijzigd.Injecteer in de chromatografische kolom en neem (standaard piekoppervlak van het monster/piekoppervlak van het interne standaardmonster) als de responswaarde.Volgens het lineaire verband tussen de responswaarde en de concentratie van de werkstandaard, namelijk W= f×A, wordt een standaardcurve gemaakt.

Aan het onbekende monster wordt een bekende hoeveelheid interne standaard toegevoegd en in de kolom geïnjecteerd om de responswaarde van de te meten component te verkrijgen.Volgens de bekende coëfficiënt f kan de concentratie van de te meten component worden verkregen.

De kenmerken van de interne standaardmethode:Tijdens de operatie worden het monster en de interne standaard met elkaar gemengd en in de chromatografische kolom geïnjecteerd, zodat zolang de verhouding van de hoeveelheid gemeten component tot de interne standaard in de gemengde oplossing constant is, de verandering van het monstervolume zal de kwantitatieve resultaten niet beïnvloeden..De interne standaardmethode compenseert de invloed van het monstervolume en zelfs de mobiele fase en detector, en is dus nauwkeuriger dan de externe standaardmethode.

DEEL
08 Factoren die van invloed zijn op kwantitatieve analyseresultaten

Een slechte nauwkeurigheid kan worden veroorzaakt door:

Onjuiste integratie van het piekgebied, ontleding van monsters of onzuiverheden die tijdens de monstervoorbereiding zijn geïntroduceerd, monsterflesje niet afgedicht, vervluchtiging van monsters of oplosmiddel, onjuiste monstervoorbereiding, problemen met monsterinjectie, onjuiste voorbereiding van de interne standaard

Mogelijke redenen voor slechte nauwkeurigheid:

Onjuiste piekintegratie, injectie- of injectorproblemen, monsterontleding of onzuiverheden geïntroduceerd tijdens monstervoorbereiding, chromatografische problemen, verminderde detectorrespons