Vloeistofchromatografie is de belangrijkste methode voor het testen van de inhoud van elke component en de onzuiverheden in grondstoffen, tussenproducten, preparaten en verpakkingsmaterialen, maar voor veel stoffen bestaan er geen standaardmethoden waarop ze kunnen vertrouwen, dus het is onvermijdelijk om nieuwe methoden te ontwikkelen. Bij de ontwikkeling van vloeistoffasemethoden vormt de chromatografische kolom de kern van vloeistofchromatografie, dus het kiezen van een geschikte chromatografische kolom is van cruciaal belang. In dit artikel legt de auteur uit hoe u een vloeistofchromatografiekolom kiest op basis van drie aspecten: algemene ideeën, overwegingen en toepassingsbereik.
A. Algemene ideeën voor het selecteren van vloeistofchromatografiekolommen
1. Evalueer de fysische en chemische eigenschappen van de analyt: zoals chemische structuur, oplosbaarheid, stabiliteit (zoals of het gemakkelijk te oxideren/reduceren/hydrolyseren is), zuurgraad en alkaliteit, enz., vooral de chemische structuur is de sleutel factor bij het bepalen van de eigenschappen, zoals de geconjugeerde groep heeft een sterke ultraviolette absorptie en sterke fluorescentie;
2. Bepaal het doel van de analyse: of hoge scheiding, hoge kolomefficiëntie, korte analysetijd, hoge gevoeligheid, hoge drukweerstand, lange levensduur van de kolom, lage kosten, enz. vereist zijn;
- Kies een geschikte chromatografische kolom: begrijp de samenstelling, fysische en chemische eigenschappen van het chromatografische vulmiddel, zoals de deeltjesgrootte, poriegrootte, temperatuurtolerantie, pH-tolerantie, adsorptie van de analyt, enz.
- Overwegingen bij het selecteren van vloeistofchromatografiekolommen
In dit hoofdstuk worden de factoren besproken waarmee rekening moet worden gehouden bij het selecteren van een chromatografiekolom vanuit het perspectief van de fysische en chemische eigenschappen van de chromatografiekolom zelf. 2.1 Vulmatrix
2.1.1 Silicagelmatrix De vulmatrix van de meeste vloeistofchromatografiekolommen is silicagel. Dit type vulmiddel heeft een hoge zuiverheid, lage kosten, hoge mechanische sterkte en is gemakkelijk te modificeren van groepen (zoals fenylbinding, aminobinding, cyanobinding, enz.), maar de pH-waarde en het temperatuurbereik dat het tolereert zijn beperkt: de Het pH-bereik van de meeste silicagelmatrixvullers is 2 tot 8, maar het pH-bereik van speciaal gemodificeerde silicagelgebonden fasen kan oplopen tot 1,5 tot 10, en er zijn ook speciaal aangepaste silicagelgebonden fasen die stabiel zijn bij lage pH. zoals Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, dat stabiel is bij pH 1 tot 8; de bovenste temperatuurlimiet van de silicagelmatrix is meestal 60 ℃, en sommige chromatografiekolommen kunnen een temperatuur van 40 ℃ verdragen bij hoge pH.
2.1.2 Polymeermatrix Polymeervulstoffen zijn meestal polystyreen-divinylbenzeen of polymethacrylaat. Hun voordelen zijn dat ze een breed pH-bereik kunnen verdragen – ze kunnen worden gebruikt in het bereik van 1 tot 14, en ze zijn beter bestand tegen hoge temperaturen (kunnen oplopen tot boven de 80 °C). Vergeleken met op silica gebaseerde C18-vulstoffen heeft dit type vulmiddel een sterkere hydrofobiciteit en is het macroporeuze polymeer zeer effectief bij het scheiden van monsters zoals eiwitten. De nadelen zijn dat de kolomefficiëntie lager is en de mechanische sterkte zwakker is dan die van vulstoffen op silicabasis. 2.2 Deeltjesvorm
De meeste moderne HPLC-vulstoffen zijn bolvormige deeltjes, maar soms zijn het onregelmatige deeltjes. Bolvormige deeltjes kunnen zorgen voor een lagere kolomdruk, een hogere kolomefficiëntie, stabiliteit en een langere levensduur; bij gebruik van mobiele fasen met een hoge viscositeit (zoals fosforzuur) of wanneer de monsteroplossing viskeus is, hebben onregelmatige deeltjes een groter specifiek oppervlak, wat bevorderlijker is voor de volledige werking van de twee fasen, en is de prijs relatief laag. 2.3 Deeltjesgrootte
Hoe kleiner de deeltjesgrootte, hoe hoger de kolomefficiëntie en hoe hoger de scheiding, maar hoe slechter de hogedrukweerstand. De meest gebruikte kolom is de kolom met een deeltjesgrootte van 5 μm; als de scheidingsvereiste hoog is, kan een vulmiddel van 1,5-3 μm worden geselecteerd, wat bevorderlijk is voor het oplossen van het scheidingsprobleem van sommige complexe matrix- en meercomponentenmonsters. UPLC kan 1,5 μm vulstoffen gebruiken; Voor semi-preparatieve of preparatieve kolommen worden vaak vulstoffen met een deeltjesgrootte van 10 μm of groter gebruikt. 2.4 Koolstofgehalte
Het koolstofgehalte verwijst naar het aandeel van de gebonden fase op het oppervlak van silicagel, dat verband houdt met het specifieke oppervlak en de dekking van de gebonden fase. Een hoog koolstofgehalte zorgt voor een hoge kolomcapaciteit en hoge resolutie, en wordt vaak gebruikt voor complexe monsters die een hoge scheiding vereisen, maar vanwege de lange interactietijd tussen de twee fasen is de analysetijd lang; chromatografische kolommen met een laag koolstofgehalte hebben een kortere analysetijd en kunnen verschillende selectiviteiten vertonen, en worden vaak gebruikt voor eenvoudige monsters die snelle analyse vereisen en monsters die hoge waterfaseomstandigheden vereisen. Over het algemeen varieert het koolstofgehalte van C18 van 7% tot 19%. 2.5 Poriëngrootte en specifiek oppervlak
HPLC-adsorptiemedia zijn poreuze deeltjes en de meeste interacties vinden plaats in de poriën. Daarom moeten moleculen de poriën binnendringen om te worden geadsorbeerd en gescheiden.
Poriëngrootte en specifiek oppervlak zijn twee complementaire begrippen. Een kleine poriegrootte betekent een groot specifiek oppervlak, en omgekeerd. Een groot specifiek oppervlak kan de interactie tussen monstermoleculen en gebonden fasen vergroten, de retentie verbeteren, de monsterbelading en kolomcapaciteit vergroten, en de scheiding van complexe componenten. Volledig poreuze fillers behoren tot dit type fillers. Voor mensen met hoge scheidingseisen wordt aanbevolen om vulstoffen met een groot specifiek oppervlak te kiezen; Een klein specifiek oppervlak kan de tegendruk verminderen, de kolomefficiëntie verbeteren en de evenwichtstijd verkorten, wat geschikt is voor gradiëntanalyse. Kern-schaalvullers behoren tot dit soort vulstoffen. Om scheiding te garanderen, wordt het aanbevolen om vulstoffen met een klein specifiek oppervlak te kiezen voor mensen met hoge eisen aan de analyse-efficiëntie. 2.6 Poriënvolume en mechanische sterkte
Het porievolume, ook wel ‘porievolume’ genoemd, verwijst naar de grootte van het lege volume per eenheidsdeeltje. Het kan de mechanische sterkte van het vulmiddel goed weerspiegelen. De mechanische sterkte van fillers met een groot poriënvolume is iets zwakker dan die van fillers met een klein poriënvolume. Vulstoffen met een porievolume kleiner dan of gelijk aan 1,5 ml/g worden meestal gebruikt voor HPLC-scheiding, terwijl vulstoffen met een porievolume groter dan 1,5 ml/g voornamelijk worden gebruikt voor moleculaire uitsluitingschromatografie en lagedrukchromatografie. 2.7 Aftoppingspercentage
Capping kan de staartpieken verminderen die worden veroorzaakt door de interactie tussen verbindingen en blootgestelde silanolgroepen (zoals ionische binding tussen alkalische verbindingen en silanolgroepen, van der Waals-krachten en waterstofbruggen tussen zure verbindingen en silanolgroepen), waardoor de kolomefficiëntie en piekvorm worden verbeterd . Niet-afgedekte gebonden fasen zullen verschillende selectiviteiten produceren ten opzichte van afgetopte gebonden fasen, vooral voor polaire monsters.
- Toepassingsgebied van verschillende vloeistofchromatografiekolommen
In dit hoofdstuk wordt het toepassingsgebied van verschillende typen vloeistofchromatografiekolommen aan de hand van enkele cases beschreven.
3.1 C18-chromatografische kolom met omgekeerde fase
De C18-kolom is de meest gebruikte kolom met omgekeerde fase, die kan voldoen aan de inhouds- en onzuiverheidstesten van de meeste organische stoffen, en is toepasbaar op middenpolaire, zwak polaire en niet-polaire stoffen. Het type en de specificatie van de C18-chromatografische kolom moeten worden geselecteerd op basis van de specifieke scheidingsvereisten. Voor stoffen met hoge scheidingseisen worden bijvoorbeeld vaak specificaties van 5 μm*4,6 mm*250 mm gebruikt; voor stoffen met complexe scheidingsmatrices en vergelijkbare polariteit kunnen specificaties van 4 μm*4,6 mm*250 mm of kleinere deeltjesgroottes worden gebruikt. De auteur gebruikte bijvoorbeeld een kolom van 3 μm*4,6 mm*250 mm om twee genotoxische onzuiverheden in celecoxib API te detecteren. De scheiding van de twee stoffen kan een waarde van 2,9 bereiken, wat uitstekend is. Bovendien wordt, vanuit het uitgangspunt om scheiding te garanderen, als snelle analyse vereist is, vaak een korte kolom van 10 mm of 15 mm gekozen. Toen de auteur bijvoorbeeld LC-MS/MS gebruikte om een genotoxische onzuiverheid in piperaquinefosfaat-API te detecteren, werd een kolom van 3 μm*2,1 mm*100 mm gebruikt. De scheiding tussen de onzuiverheid en de hoofdcomponent was 2,0 en de detectie van een monster kan in 5 minuten worden voltooid. 3.2 fenylkolom met omgekeerde fase
Fenylkolom is ook een type kolom met omgekeerde fase. Dit type kolom heeft een sterke selectiviteit voor aromatische verbindingen. Als de respons van aromatische verbindingen, gemeten met een gewone C18-kolom, zwak is, kunt u overwegen de fenylkolom te vervangen. Toen ik bijvoorbeeld celecoxib API aan het maken was, was de respons van het hoofdbestanddeel, gemeten door de fenylkolom van dezelfde fabrikant en dezelfde specificatie (allemaal 5 μm*4,6 mm*250 mm), ongeveer zeven keer zo groot als die van de C18-kolom. 3.3 Normale fasekolom
Als effectieve aanvulling op de omgekeerde-fasekolom is de normale-fasekolom geschikt voor zeer polaire verbindingen. Als de piek nog steeds erg snel is bij het elueren met meer dan 90% waterfase in de omgekeerde-fasekolom, en zelfs dicht bij en overlapt met de oplosmiddelpiek, kunt u overwegen de normale-fasekolom te vervangen. Dit type kolom omvat een hilic-kolom, een aminokolom, een cyaankolom, enz.
3.3.1 Hilic-kolom De hilic-kolom integreert doorgaans hydrofiele groepen in de gebonden alkylketen om de reactie op polaire stoffen te versterken. Dit type kolom is geschikt voor de analyse van suikerstoffen. De auteur gebruikte dit type column bij de inhoud en verwante stoffen van xylose en zijn derivaten. Ook de isomeren van een xylosederivaat kunnen goed gescheiden worden;
3.3.2 Aminokolom en cyaankolom Aminokolom en cyaankolom verwijzen naar de introductie van respectievelijk amino- en cyaanmodificaties aan het einde van de gebonden alkylketen om de selectiviteit voor speciale stoffen te verbeteren: een aminokolom is bijvoorbeeld een goede keuze voor de scheiding van suikers, aminozuren, basen en amiden; cyanokolom heeft een betere selectiviteit bij het scheiden van gehydrogeneerde en niet-gehydrogeneerde structureel vergelijkbare stoffen vanwege de aanwezigheid van geconjugeerde bindingen. Aminokolom en cyanokolom kunnen vaak worden geschakeld tussen normale fasekolom en omgekeerde fasekolom, maar veelvuldig schakelen wordt niet aanbevolen. 3.4 Chirale kolom
Chirale kolom is, zoals de naam al doet vermoeden, geschikt voor de scheiding en analyse van chirale verbindingen, vooral op het gebied van farmaceutische producten. Dit type kolom kan worden overwogen wanneer conventionele kolommen met omgekeerde fase en normale fase de scheiding van isomeren niet kunnen bewerkstelligen. De auteur gebruikte bijvoorbeeld een chirale kolom van 5 μm*4,6 mm*250 mm om de twee isomeren van 1,2-difenylethyleendiamine te scheiden: (1S, 2S)-1, 2-difenylethyleendiamine en (1R, 2R)-1, 2 -difenylethyleendiamine, en de scheiding tussen de twee bereikte ongeveer 2,0. Chirale kolommen zijn echter duurder dan andere typen kolommen, meestal 1W+/stuk. Als er behoefte is aan dergelijke kolommen, moet de eenheid daarvoor voldoende budget opmaken. 3.5 Ionenuitwisselingskolom
Ionenuitwisselingskolommen zijn geschikt voor de scheiding en analyse van geladen ionen, zoals ionen, eiwitten, nucleïnezuren en sommige suikerstoffen. Afhankelijk van het vultype zijn ze onderverdeeld in kationenuitwisselingskolommen, anionenuitwisselingskolommen en sterke kationenuitwisselingskolommen.
Kationenuitwisselingskolommen omvatten kolommen op calcium- en waterstofbasis, die voornamelijk geschikt zijn voor de analyse van kationische stoffen zoals aminozuren. De auteur gebruikte bijvoorbeeld kolommen op calciumbasis bij het analyseren van calciumgluconaat en calciumacetaat in een spoeloplossing. Beide stoffen vertoonden sterke reacties bij λ=210 nm, en de scheidingsgraad bereikte 3,0; de auteur gebruikte kolommen op waterstofbasis bij het analyseren van glucosegerelateerde stoffen. Verschillende belangrijke verwante stoffen – maltose, maltotriose en fructose – hadden een hoge gevoeligheid onder differentiële detectoren, met een detectielimiet van slechts 0,5 ppm en een scheidingsgraad van 2,0-2,5.
Anionenuitwisselingskolommen zijn vooral geschikt voor de analyse van anionische stoffen zoals organische zuren en halogeenionen; sterke kationenuitwisselingskolommen hebben een hogere ionenuitwisselingscapaciteit en selectiviteit en zijn geschikt voor de scheiding en analyse van complexe monsters.
Het bovenstaande is slechts een inleiding tot de typen en toepassingsbereiken van verschillende gangbare vloeistofchromatografiekolommen, gecombineerd met de eigen ervaring van de auteur. Er zijn andere speciale typen chromatografiekolommen in daadwerkelijke toepassingen, zoals chromatografische kolommen met grote poriën, chromatografische kolommen met kleine poriën, affiniteitschromatografiekolommen, multimode chromatografische kolommen, ultrahoge prestatie vloeistofchromatografiekolommen (UHPLC), superkritische vloeistofchromatografiekolommen ( SFC), enz. Ze spelen een belangrijke rol op verschillende gebieden. Het specifieke type chromatografische kolom moet worden geselecteerd op basis van de structuur en eigenschappen van het monster, scheidingsvereisten en andere doeleinden.
Posttijd: 14 juni 2024