De mobiele fase is equivalent aan de vloeibare fase van bloed, en er zijn verschillende zaken waar je op moet letten tijdens het gebruik. Onder hen zijn er enkele “valkuilen” waaraan aandacht moet worden besteed.
01. Meet de pH van de mobiele fase na toevoeging van organisch oplosmiddel
Als u de pH meet met een organisch additief, zal de pH die u krijgt anders zijn dan voordat u het organische oplosmiddel toevoegt. Het belangrijkste is echter om consistent te zijn. Als u altijd de pH meet nadat u het organische oplosmiddel heeft toegevoegd, zorg er dan voor dat u uw stappen vermeldt in de methode die u gebruikt, zodat anderen dezelfde methode zullen volgen. Deze methode is niet 100% nauwkeurig, maar zorgt er in ieder geval voor dat de methode consistent blijft. Dit kan belangrijker zijn dan het verkrijgen van een nauwkeurige pH-waarde.
02. Geen buffer gebruikt
Het doel van een buffer is om de pH te controleren en te voorkomen dat deze verandert. Veel andere methoden veranderen de pH van de mobiele fase, wat verschuivingen in de retentietijd, piekvorm en piekrespons kan veroorzaken.
Mierenzuur, TFA, enz. zijn geen buffers
03. Er wordt geen buffer gebruikt binnen het normale pH-bereik
Elke buffer heeft een bereikbreedte van 2 pH-eenheden, waarbinnen deze de beste pH-stabiliteit biedt. Buffers buiten dit venster bieden geen effectieve weerstand tegen pH-veranderingen. Gebruik een buffer in het juiste bereik, of kies een buffer die het pH-bereik dekt dat je nodig hebt.
04. Voeg buffer toe aan de organische oplossing
Het mengen van een bufferoplossing met een organische fase zal er hoogstwaarschijnlijk voor zorgen dat de buffer neerslaat. Zelfs als er neerslag heeft plaatsgevonden, is dit in veel gevallen nog steeds moeilijk te detecteren. Vergeet niet om altijd de organische oplossing aan de waterfase toe te voegen, dit kan de kans op bufferprecipitatie aanzienlijk verkleinen.
05. Meng de concentratiegradiënt vanaf 0% met een pomp
De pompen die vandaag de dag beschikbaar zijn, kunnen mobiele fasen effectief mengen en inline ontgassen, maar niet iedereen die uw methode gebruikt, zal een pomp van hoge kwaliteit hebben. Meng A en B tot één oplossing en voer deze 100% inline uit.
Er kan bijvoorbeeld 950 ml organisch uitgangsmengsel worden bereid door te mengen met 50 ml water. Het voordeel hiervan is dat het de variabiliteit tussen HPLC's kan verminderen en de kans op bellen en neerslag in het systeem kan verminderen. Het is vermeldenswaard dat de verhouding van het pompmengsel 95:5 is, wat niet betekent dat de voorgemengde retentietijd in de fles ook 95:5 is.
06. Het niet gebruiken van het juiste gemodificeerde zuur (base) om de buffer te veranderen
Gebruik alleen het zuur of de base die het bufferzout vormt dat u gebruikt. Een natriumfosfaatbuffer moet bijvoorbeeld worden bereid met alleen fosforzuur of natriumhydroxide.
07. Niet alle informatie over de buffer vermelden in de methode, zoals het toevoegen van 5 gnatriumfosfaat op 1000 ml water.
Het type buffer bepaalt het pH-bereik dat kan worden gebufferd. De benodigde concentratie bepaalt de buffersterkte. 5 gram watervrij natriumfosfaat en 5 gram mononatriumfosfaatmonohydraat hebben verschillende buffersterktes.
08. Organische oplosmiddelen toevoegen vóór controle
Als bij de vorige methode gebruik werd gemaakt van een bufferoplossing voor basislijn B, en uw methode gebruikt een organische oplossing voor basislijn B, kunt u de buffer hopelijk in de pompslangen en de pompkop laten bezinken.
09. Til het flesje op en leeg de laatste druppel
De kans is groot dat u niet voldoende mobiele fase heeft om de hele run te voltooien en dat uw monster gaat roken. Naast de mogelijkheid dat het pompsysteem en de kolom doorbranden, zal de mobiele fase volledig verdampen en zal de mobiele fase bovenaan de fles veranderen.
10. Gebruik ultrasone ontgassing mobiele fase
Het belangrijkste is om ervoor te zorgen dat alle bufferzouten zijn opgelost, maar dit is de slechtste manier om te ontgassen en zal de mobiele fase snel opwarmen, waardoor de organische componenten verdampen. Om later onnodige problemen te voorkomen, neem je vijf minuten de tijd om je mobiele fase vacuüm te filteren.
Posttijd: 27 augustus 2024